VetLine Leishmania, Elisa kit
Inmunoensayo enzimático para la determinación cualitativa de anticuerpos frente Leishmania en suero de mamíferos.
Referencia:
LEIVT0310
Contenido:
Unidades
Unidad de venta:
Kit
El ELISA NovaTec VetLine Leishmania está destinado a la determinación cualitativa de anticuerpos contra Leishmania en suero veterinario.
La sensibilidad diagnóstica canina fue del 95,80 % y la especificidad diagnóstica canina del 95,43 % (concordancia: 95,58 %). Para más detalles, consulte el informe de resultados.
Solo para uso veterinario in-vitro.
11
ESPAÑOL
1. INTRODUCCIÓN
La Leishmaniosis es una enfermedad infecciosa transmitida por un tipo de mosca (coloquialmente, moscas de la arena) y
causada por distintas especies de Leishmania. Los parásitos pueden infectar tanto caninos como humanos, y la condición
resultante se conoce como leishmaniosis visceral.
Esta enfermedad es particularmente común en la cuenca mediterránea (p.ej., Italia, España y Portugal), los Balcanes, centro y
sud-este asiático, norte y nor-este de China, norte y África subsahariana, y partes de América Central y sud-América. El perro
doméstico parece ser el reservorio principal para la leishmaniosis visceral en humanos, haciendo que el control de la
enfermedad sea mucho más vital.
Las manifestaciones clínicas en perros incluyen caquexia crónica, epistaxis, diarrea, conjuntivitis, síntomas oculares (uveítis
anterior, retinitis), severa atrofia muscular, hinchazón de las extremidades y las articulaciones, cojera, linfadenopatía, poliartritis,
y nefropatía con pérdida de proteínas, lo que puede conducir a insuficiencia renal.
La evaluación de la infección renal en todos los perros infectados es de crítica importancia.
La infección se puede identificar mediante
▪ - Microscopia
▪ - Serología: IFA, ELISA
2. USO PREVISTO
El enzimoinmunoensayo de NovaTec VetLine Leishmania ELISA se utiliza para la determinación cualitativa de anticuerpos
contra Leishmania en suero de veterinario.
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
La determinación inmunoenzimático cualitativa de anticuerpos específicos se basa en la técnica ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay).
Las Placas de Microtitulación están recubiertas con antígenos específicos unen a los anticuerpos de la muestra. Después de
lavar los pocillos para eliminar todo el material de muestra no unido, el conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) se añade.
Este conjugado se une a los anticuerpos capturados. En una segunda etapa de lavado se retira el conjugado no unido. El
complejo inmune formado por el conjugado unido se visualizó añadiendo substrato tetrametilbencidina (TMB), que da un
producto de reacción azul.
La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos en la muestra. se añade ácido sulfúrico
para detener la reacción. Esto produce un cambio de color de azul a amarillo. La extinción a 450/620 nm se mide con un
fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA.
4. MATERIALES
4.1. Reactivos suministrados
▪ Placa de Microtitulación: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antígenos de Leishmania, en bolsa de
aluminio.
▪ Tampón de Dilución de Muestras:1 botella de 100 mL de solución de tampón de fosfato (10 mM) para diluir la
muestra; pH 7,2 ± 0,2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/MIT (3:1).
▪ Solución de Parada: 1 botella de 15 mL de ácido sulfúrico, 0,2 mol/L, listo para ser utilizado; tapa roja.
▪ Tampón de Lavado (20x conc.): 1 botella de 50 mL de una solución de tampón de fosfato 20x concentrado (0,2 M)
para lavar los pocillos; pH 7,2 ± 0,2; tapa blanca.
▪ Conjugado: 1 botella de 20 mL Proteina A/G conjugada con peroxidasa de rábano (HRP); color amarillo; tapa blanca;
listo para ser utilizado; ≤ 0.02 % (v/v) MIT.
▪ Solución de Sustrato de TMB: 1 botella de 15 mL 3,3’,5,5’-tetrametilbenzindina (TMB), < 0,1 %; listo para ser
utilizado; tapa amarilla.
▪ Control Positivo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa roja; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
▪ Control Cut-off: 1 botella de 3 mL control; color amarillo; tapa verde; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
▪ Control Negativo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa azul; listo para ser utilizado; ≤ 0,0015% (v/v)
CMIT/MIT (3:1).
Para indicaciones de peligro y consejos de prudencia consulte el cap. 12.1.
Para sustancias potencialmente peligrosas por favor revise la ficha de datos de seguridad.
4.2. Accesorios suministrados
▪ 1 lámina autoadhesiva
▪ 1 instrucciones de uso
▪ 1 esquema de la placa
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4.3. Materiales e instrumentos necesarios
▪ Fotómetro de Placa de Microtitulación con filtros de 450/620 nm
▪ Incubadora 37 °C
▪ Dispositivo de lavado manual o automático para Placa de Microtitulación
▪ Micropipetas para uso de (10-1000 µL)
▪ Mezcladora Vortex
▪ Agua destilada
▪ Tubos de plástico desechables
5. ESTABILIDAD Y ALMACENAJE
Almacene el kit a 2...8 °C. Los reactivos abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se
almacena a 2...8 °C.
6. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Es muy importante llevar todos los reactivos y las muestras para a la temperatura ambiente (20...25 °C) y
mezclarlos antes de serem utilizados!
6.1. Placa de Microtitulación
As tiras rompibles están recubiertas con antígenos del Leishmania; Inmediatamente después de la eliminación de las tiras, las
tiras restantes deben sellarse de nuevo en el papel de aluminio junto con la bolsita di dióxio de silicio y almacenar a 2...8 °C.
6.2. Tampón de Lavado (20x conc.)
Diluir la Tampón de Lavado 1+19; por ejemplo 10 mL de la Tampón de Lavado + 190 mL de agua destilada. La Tampón de
Lavado diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente o a 2...8 °C. Caso aparecen cristales en el concentrado,
calentar la solución a 37 °C, por ejemplo, en un baño María. Mezclar bien antes de la dilución.
6.3. Solución de Sustrato de TMB
La solución está listo para su uso y debe almacenarse a 2...8 °C, protegida de la luz. La solución debe ser incolora o podría
tener un color ligeramente azul claro. Si el sustrato se convierte en azul, es posible que haya sido contaminado y no puede ser
utilizada en el ensayo.
7. TOMA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Usar muestras de suero canino con este ensayo. Si el ensayo se realiza dentro de 5 días después de la toma de sangre, las
muestras pueden ser almacenadas de 2...8 °C, en caso contrario deben ser alicotadas y almacenadas congeladas
(-70...-20 °C). Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
No se recomienda la inactivación por calor de las muestras.
7.1. Dilución de las muestras
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1 + 100 con el Tampón de Dilución de Muestras, por
ejemplo 10 µL de la muestra con 1 mL de Tampón de Dilución de Muestras, mezclar bien con la mezcladora Vortex.
8. PROCEDIMIENTO
Por favor, leer cuidadosamente las instrucciones de uso del ensayo antes de realizarlo. Para el buen funcionamiento de la
técnica es necesario seguir las instrucciones. El siguiente procedimiento es válido solamente para el método manual. Si se
realiza el ensayo en los sistemas automáticos de ELISA es aconsejable elevar el número de lavado de tres hasta cinco veces y
el volumen de Tampón de Lavado de 300 µL a 350 µL para excluir efectos de lavado. Preste atención al capítulo 12. Antes de
comenzar, especificar exactamente la repartición y posición de las muestras y de los estándares/controles (recomienda
determinar en doble) en lo esquema de la placa suministrada. Usar la cantidad necesaria de tiras o pozos e insertarlos en el
soporte.
Realizar el ensayo en el orden indicado y sin retraso.
Para cada paso de pipeteado en los estándares/controles y en las muestras, usar siempre puntas de pipeta de un solo uso.
Graduar la incubadora a 37 1°C.
1. Pipetear 100 µL de estándares/controles y muestras en los pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el blanco.
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37 1°C.
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y lavarla tres veces con 300 µL de la
Tampón de Lavado. Evitar el rebosamiento de los pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser
> 5 segundos. Para sacar el líquido restante de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente.
Nota: El lavado es muy importante! Un mal lavado insuficiente provoca una baja precisión y resultados falsamente
elevados!
5. Pipetar 100 µL de Conjugado en cada pocillo con excepción del blanco substrato A1.
6. Incubar 30 min a la temperatura ambiente (20…25 °C). Evitar la luz solar directa.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8. Pipetar 100 µL de la Solución de Sustrato de TMB en todos los pocillos.
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9. Incubar exactamente 15 min en oscuridad a temperatura ambiente (20...25 °C). Un color azul se produce en las
muestras positivas debido a la reacción enzimática.
10. Pipetear en todos los pocillos 100 µL de la Solución de Parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como
con la Solución de Sustrato de TMB, por lo tanto un cambio de color de azul a amarillo se produce.
11. Medir la extinción con 450/620 nm en un periodo de 30 min después de añadir la Solución de Parada.
8.1. Medición
Ajustar el fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA al cero utilizando el Blanco.
Si por razones técnicas el fotómetro de Placa de Microtitulación de ELISA no se pueder ajustar a cero utilizando el Blanco, el
valor de la absorbancia desto debe ser sustraído de los demás valores de absorbancia medidos con el fin de obtener
resultados fiables!
Medir la extinción de todos los pocillos con 450 nm y anotar los resultados de los estándares/controles y de las muestras en la
esquema de la placa.
Es aconsejable realizar la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620 nm.
Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extinción de los pocillos
correspondientes.
9. CALCULO DE LOS RESULTADOS
9.1. Criterios de validez del ensayo
El ensayo es válido si se cumplen los siguientes criterios:
▪ Blanco: valor de la extinción < 0,100
▪ Control negativo: valor de la extinción < 0,200 y < Cut-off
▪ Control cut-off: valor de la extinción 0,150 – 1,300
▪ Control positivo: valor de la extinción > Cut-off
Si estos criterios no se cumplen, la prueba no es váida y deberá repetirse.
9.2. Calculo del valor de la medición
El Cut-off se obtiene de los valores de la extinción de lo Control cut-off.
Ejemplo: 0,42 OD Control cut-off + 0,44 OD Control cut-off = 0,86:2 = 0,43
Cut-off = 0,43
9.2.1. Resultados en unidades [NTU]
Promedio valor de la extinción de la muestra x 10 = [NovaTec-unidades = NTU]
Cut-off
Ejemplo: 1,591 x 10 = 37 NTU
0,43
9.3. Interpretación de los resultados
Los intervalos de valores normales para el ELISA deben ser establecidos por cada laboratorio con base en las muestras de la
propia población en las áreas geográficas atendidas.
Estos son los datos normativos:
Cut-off
10 NTU
-
Positivo
> 11 NTU
Los anticuerpos contra el patógeno están presentes. Ha producido un
contacto con el antígeno (patógeno resp. vacuna).
Zona intermedia
9 – 11 NTU
Los anticuerpos contra el patógeno no se pudieron detectar claramente.
Se recomienda repetir la prueba con una muestra fresca en 2 a 4 semanas.
Si el resultado es de nuevo en la zona intermedia, la muestra se considera
como negativa.
Negativo
< 9 NTU
La muestra no contiene anticuerpos contra el patógeno. Un contacto previo
con el antígeno (patógeno resp. vacuna) es poco probable.
El diagnóstico de una infección no solamente se debe basar en el resultado del ensayo.
Es necesario considerar la anamnésis y la sintomatología junto al resultado serológico.
10. CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO
Los resultados están basados en lo gruppo de pruebas investigado; no se trata de especificaciones garantizadas.
Los datos de rendimiento se han determinado con muestras de suero caninos. Debido a las propiedades del conjugado
proteína A/G, el ELISA debe reaccionar con las muestras de todos mamíferos.
Información más detallada está disponible bajo petición.
14
10.1. Precisión
Intra ensayo n Promedio (E) CV (%)
#1
24
0.463
4.25
#2
24
1.245
5.95
#3
24
0.727
3.59
Inter ensayo n Promedio (NTU) CV (%)
#1
12
27.34
4.94
#2
12
29.33
6.54
#3
12
1.23
14.19
10.2. Especificad Diagnóstica
La especificidad del ensayo se define como la probabilidad que tiene el ensayo de dar un resultado negativo en ausencia del
analítico específico.
Especificad diagnóstica canino: 95,43 % (95 % Intervalo de confianza: 91,19 % - 98,01 %)
10.3. Sensibilidad de Diagnóstico
La sensibilidad del ensayo se define como la probabilidad que tiene el ensayo de dar un resultado positivo en presencia del
analítico específico.
Sensibilidad de diagnóstico canino: 95,80 % (95 % Intervalo de confianza: 90,47 % - 98,62 %)
10.4. Interferencias
Las muestras lipémicas, ictéricas e hemolíticas no mostraron interferencias con este equipo ELISA hasta una concentración de
5 mg/mL para triglicéridos, de 0,5 mg/mL para bilirrubina y de 10 mg/mL hemoglobina.
10.5. Reacción cruzada
Las reacciones cruzadas, en particular con Trypanosoma cruzi (Chagas), no pueden ser excluidas.
11. LIMITACIONES DEL ENSAYO
Una contaminación de las muestras con bacterias, o una congelación y descongelación repetida pueden producir cambios en
los valores de la extinción.
12. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
▪ Solo para diagnósticos veterinarios in vitro.
▪ Todos los materiales di origen humana o animal deveram ser considerados y tratados como potencialmente infecciosos.
▪ Todos los componentes de origen humano han sido examinados y resultaron no reactivos a anticuerpos contra el VIH,
VHC y HbsAG.
▪ No intercambiar reactivos y placas de microtítulo de cargas diferentes.
▪ No usar reactivos de otro fabricante para este ensayo.
▪ No usar después de la fecha de caducidad.
▪ Sólo usar recambios de pipetas, dispensadores y materiales de laboratorio limpios.
▪ No intercambiar las tapas de los diferentes reactivos, para evitar la contaminación cruzada.
▪ Para evitar la evaporación y una contaminación microbiana, cierre inmediatamente las botellas después de usarlas.
▪ Después de abrirlas y posterior almacenaje, asegurarse de que no existe contaminación microbiana antes de seguir
usándolas.
▪ Para evitar contaminaciones cruzadas y resultados erróneamente aumentados, pipetear cuidadosamente las muestras y
los reactivos en los pocillos sin salpicar.
▪ El ELISA está pensado exclusivamente para su uso por personal especializado que domine perfectamente las técnicas de
trabajo.
12.1. Nota de seguridad para los reactivos que contienen sustancias peligrosas
Los reactivos pueden contener CMIT/MIT (3:1) o MIT (consulte el cap. 4.1)
Por lo tanto, se aplican las indicaciones de peligro y consejos de prudencia.
Atención
H317
Puede provocar una reacción alérgica en la piel.
261
Evitar respirar el aerosol.
P280
Llevar guantes/prendas.
P302+P352
EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante jabón agua.
P333+P313
En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico.
P362+P364
Quitar las prendas contaminadas y lavarlas antes de volver a usarlas.
Se puede encontrar más información en la ficha de datos de seguridad.
15
12.2. Indicaciones para la eliminación de residuos
Por regla general, los productos químicos y las preparaciones son residuos peligrosos. Su eliminación esta sometida a las
leyes y los decretos nacionales sobre la eliminación de residuos. Las autoridades informan sobre la eliminación de residuos
peligroso.
13. INFORMACIONES PARA PEDIDOS
N° del producto: LEIVT0310 VetLine Leishmania ELISA (96 determinaciones)
18
BIBLIOGRAPHY / LITERATUR / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA /
BIBLIOGRAFIA
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Rev. Inf. Dis. 6:736-744
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Eliasson, M., et al. 1988. Chimeric IgG-binding receptors engineered from staphylococcal protein A and streptococcal protein G.
J. Biol. Chem. 263(9):4323-7.
ABBREVIATIONS / ABKÜRZUNGEN / ABRÉVIATIONS / ABBREVIAZIONI / ABREVIACIÓNES /
ABREVIATURAS
CMIT
5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one
MIT
2-methyl-2H-isothiazol-3-one
19
SYMBOLS KEY / SYMBOLSCHLÜSSEL / EXPLICATION DES SYMBOLES / LEGENDA /
SIMBOLOS / TABELA DE SIMBOLOS
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por /
Fabricado por
LOT
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de lot / Lotto / Número de lote /
Número de lote
Expiration Date / Verfallsdatum / Date de péremption / Scadenza /
Fecha de caducidad / Data de Validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de conservation /
Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de
Armazenamento
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence du catalogue / Numero di codice /
Número de Catálogo / Número de Catálogo
Consult Instructions for Use / Arbeitsanleitung beachten / Consulter la notice
d’utilisation / Consultare le istruzioni per l’uso/ Consulte las Instrucciones de Uso /
Consultar as Instruções de Utilização
MTP
Microtiterplate / Mikrotiterplatte / Plaque de Microtitrage / Piastre di Microtitolazione /
Placa de Microtitulación / Placa de Microtitulação
CONJL
Conjugate / Konjugat / Conjugué / Coniugato / Conjugado / Conjugado
CONTROL│-
Negative Control / Negativkontrolle / Contrôle Négatif / Controllo Negativo / Control
Negativo / Controle Negativo
CONTROL│+
Positive Control / Positivkontrolle / Contrôle Positif / Controllo Positivo /
Control Positivo / Controle Positivo
CUT OFF
Cut-off Control / Cut-off Kontrolle / Contrôle Cut-off / Controllo Cut-off /
Control Cut-off / Controle Cut-off
DIL
Sample Dilution Buffer / Probenverdünnungspuffer / Tampon de Dilution
d’Échantillon / Tampone di Diluizione del Campione / Tampón de Dilución de
Muestras / Tampão de Diluição de Amostra
SOLN│STOP
Stop Solution / Stopplösung / Solution d’Arrêt / Soluzione Bloccante / Solución de
Parada /Solução de Bloqueio
SUB│TMB
TMB Substrate Solution / TMB-Substratlösung / Solution de Substrat TMB /
Soluzione Substrato TMB / Solución de Sustrato de TMB / Solução Substrato TMB
WASH│BUF│20x
Washing Buffer 20x concentrated / Waschpuffer 20x konzentriert / Tampon de
Lavage concentré 20 x / Tampone di Lavaggio concentrazione x20 / Tampón de
Lavado concentrado x20 / Tampão de Lavagem concentrada 20x
Contains sufficient for “n” tests / Ausreichend für “n” Tests / Contenu suffisant pour
“n” tests / Contenuto sufficiente per “n” saggi / Contenido suficiente para ”n” tests /
Conteúdo suficiente para “n” testes
20
SUMMARY OF TEST PROCEDURE / KURZANLEITUNG TESTDURCHFÜHRUNG / RÉSUMÉ DE LA
PROCEDURE DE TEST / SCHEMA DELLA PROCEDURA / RESUMEN DE LA TÉCNICA / RESUMO
DO PROCEDIMENTO DE TESTE
SCHEME OF THE ASSAY
VetLine Leishmania ELISA
Test Preparation
Prepare reagents and samples as described.
Establish the distribution and identification plan for all samples and standards/controls on the plate
layout supplied in the kit.
Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.
Assay Procedure
Substrate Blank
(A1)
Negative
Control
Cut-off
Control
Positive
Control
Sample
(diluted 1+100)
Negative Control
-
100 µL
-
-
-
Cut-off Control
-
-
100 µL
-
-
Positive Control
-
-
-
100 µL
-
Sample
(diluted 1+100)
-
-
-
-
100 µL
Cover wells with foil supplied in the kit
Incubate for 1 h at 37±1 °C
Wash each well three times with 300 µL of Washing Buffer
Conjugate
-
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
Incubate for 30 min at room temperature (20...25 °C)
Do not expose to direct sunlight
Wash each well three times with 300 µL of Washing Buffer
TMB Substrate
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
Incubate for exactly 15 min at room temperature (20...25 °C) in the dark
Stop Solution
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
Photometric measurement at 450 nm
(reference wavelength: 620 nm)
NovaTec Immundiagnostica GmbH
Waldstraße 23 A6
63128 Dietzenbach, Germany
LEIVT0310 engl,dt,es 05052020-TL
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