VetLine Leishmania, Elisa kit

Enzymimmunoassay zur qualitativen immunenzymatischen Bestimmung von Antikörpern gegen
Leishmania in veterinärem Serum.

Art. Nr.: LEIVT0310

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Verkaufseinheit Kit

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Der NovaTec VetLine Leishmania ELISA ist für die qualitative Bestimmung von Antikörpern gegen Leishmanien in Tierserum bestimmt.

Die diagnostische Sensitivität für Hunde lag bei 95,80 % und die diagnostische Spezifität für Hunde bei 95,43 % (Übereinstimmung: 95,58 %). Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte dem Leistungsbericht.

Nur für die In-vitro-Diagnostik in der Tiermedizin.

DEUTSCH

1. EINLEITUNG

Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, welche durch Sandmücken übertragen wird. Sie wird durch verschiedene Spezies

des Protozoen Leishmania verursacht. Der Parasit kann sowohl Menschen als auch Hunde infizieren. Die daraus resultierende

Erkrankung wird viszerale Leishmaniose genannt. Die Krankheit kommt in den Mittelmeerländern (z.B. Italien, Spanien und

Portugal), dem Balkan, Zentral- und Südwest-Asien, Nord- und Nordwest-China, Nord- und Subsahara-Afrika und Teilen von

Mittel- und Südamerika vor. Domestizierte Hunde sind das Hauptreservoir für die menschliche viszerale Leishmaniose. Die

Kontrolle von Hunden ist daher ausschlaggebend zur Kontrolle der Erkrankung.

In Hunden können als klinische Manifestationen häufig folgende Symptome beobachtet werden: Kräfteschwund, Nasenbluten,

Durchfall, Bindehautentzündung, Uveitis anterior, Netzhautenzündug, Muskelschwund, geschwollene Glieder und Gelenke,

Lähmungen, Lymphadenopathie, Polyarthritis und Nephropathie welche zu Nierenversagen führen kann.

Eine Funktionsprüfung der Nieren ist sehr wichtig bei infizierten Hunden.

Die Infektion kann durch folgende Methoden diagnostiziert werden:

▪ Mikroskopie

▪ Serologie: IFA, ELISA

2. VERWENDUNGSZWECK

Der NovaTec VetLine Leishmania ELISA ist für den qualitativen Nachweis spezifischer Antikörper gegen Leishmania in

veterinärem Serum bestimmt.

3. TESTPRINZIP

Die qualitative immunenzymatische Bestimmung von spezifischen Antikörpern beruht auf der ELISA (Enzyme-linked

Immunosorbent Assay) Technik.

Die Mikrotiterplatten sind mit spezifischen Antigenen beschichtet, an welche die korrespondierenden Antikörper aus der Probe

binden. Ungebundenes Probenmaterial wird durch Waschen entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe eines Meerettich-

Peroxidase (HRP) Konjugates. Dieses Konjugat bindet an die an der Mikrotiterplatte gebundenen spezifischen Antikörper. In

einem zweiten Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Die Immunkomplexe, die durch die Bindung des Konjugates

entstanden sind, werden durch die Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung und eine resultierende Blaufärbung

nachgewiesen.

Die Intensität des Reaktionsproduktes ist proportional zur Menge der spezifischen Antikörper in der Probe. Die Reaktion wird

mit Schwefelsäure gestoppt, wodurch ein Farbumschlag von blau nach gelb erfolgt. Die Absorption wird bei 450/620 nm mit

einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen.

4. MATERIALIEN

4.1. Mitgelieferte Reagenzien

▪ Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit Leishmania Antigenen; in wieder verschließbarem

Aluminiumbeutel.

▪ Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche mit 100 mL Phosphatpuffer (10 mM) zur Probenverdünnung; pH 7,2 ± 0,2; gelb

gefärbt; gebrauchsfertig; weiße Verschlusskappe; ≤ 0,0015 % (v/v) CMIT/MIT (3:1).

▪ Stopplösung: 1 Flasche mit 15 mL Schwefelsäure, 0,2 mol/L; gebrauchsfertig; rote Verschlusskappe.

▪ Waschpuffer (20x konz.): 1 Flasche mit 50 mL eines 20-fach konzentrierten Phosphatpuffers (0,2 M), zum Waschen

der Kavitäten; pH 7,2 ± 0,2; weiße Verschlusskappe.

▪ Konjugat: 1 Flasche mit 20 mL Peroxidase-konjugierten Protein A/G; gelb gefärbt; gebrauchsfertig; weiße

Verschlusskappe; ≤ 0.02 % (v/v) MIT.

▪ TMB-Substratlösung: 1 Flasche mit 15 mL 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin (TMB), < 0,1 %; gebrauchsfertig; gelbe

Verschlusskappe.

▪ Positivkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL; gelb gefärbt; rote Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0.02 % (v/v) MIT.

▪ Cut-off Kontrolle: 1 Fläschchen mit 3 mL; gelb gefärbt; grüne Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0.02 % (v/v) MIT.

▪ Negativkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL; gelb gefärbt; blaue Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,0015 % (v/v)

CMIT/MIT (3:1).

Für Gefahren- und Sicherheitshinweise siehe 12.1.

Für potenzielle Gefahrstoffe überprüfen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt.

4.2. Mitgeliefertes Zubehör

▪ 1 selbstklebende Abdeckfolie

▪ 1 Arbeitsanleitung

▪ 1 Plattenlayout

4.3. Erforderliche Materialien und Geräte

▪ Mikrotiterplatten-Photometer mit Filtern 450/620 nm

▪ Inkubator 37 °C

▪ Manuelle oder automatische Waschvorrichtung

▪ Mikropipetten (10 - 1000 µL)

▪ Vortex-Mischer

▪ Destilliertes Wasser

▪ Plastikröhrchen für den einmaligen Gebrauch

5. STABILITÄT UND LAGERUNG

Testkit bei 2...8 °C lagern. Die geöffneten Reagenzien sind bis zu den auf den Etiketten angegebenen Verfallsdaten

verwendbar, wenn sie bei 2...8 °C gelagert werden.

6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN

Es ist sehr wichtig, alle Reagenzien und Proben vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur (20...25 °C) zu bringen

und zu mischen!

6.1. Mikrotiterplatte

Die abbrechbaren Streifen sind mit Leishmania Antigenen beschichtet. Nicht verbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel

zusammen mit dem Trockenmittel sofort wieder verschließen und bei 2...8 °C lagern.

6.2. Waschpuffer (20x konz.)

Der Waschpuffer ist im Verhältnis 1 + 19 zu verdünnen; z.B. 10 mL Waschpuffer + 190 mL destilliertes Wasser.

Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur (20…25 °C) 5 Tage haltbar. Sollten Kristalle im Konzentrat auftreten, die Lösung

z.B. in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmen und vor dem Verdünnen gut mischen.

6.3. TMB-Substratlösung

Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist farblos, kann aber auch leicht

hellblau sein. Sollte die TMB-Substratlösung blau sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden.

7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN

Es sollten canine Serumproben verwendet werden. Werden die Bestimmungen innerhalb von 5 Tagen nach Blutentnahme

durchgeführt, können die Proben bei 2...8 °C aufbewahrt werden, sonst aliquotieren und tiefgefrieren (-70…-20 °C). Wieder

aufgetaute Proben vor dem Verdünnen gut schütteln. Wiederholtes Tiefgefrieren und Auftauen vermeiden!

Hitzeinaktivierung der Proben wird nicht empfohlen.

7.1. Probenverdünnung

Proben vor Testbeginn im Verhältnis 1 + 100 mit Probenverdünnungspuffer verdünnen, z. B. 10 µL Probe und 1 mL

Probenverdünnungspuffer in die entsprechenden Röhrchen pipettieren, um eine Verdünnung von 1 + 100 zu erhalten; gut

mischen (Vortex).

8. TESTDURCHFÜHRUNG

Arbeitsanleitung vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die

Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert. Beim Arbeiten mit

ELISA Automaten empfehlen wir, um Wascheffekte auszuschließen, die Zahl der Waschschritte von drei auf bis zu fünf und das

Volumen des Waschpuffers von 300 µL auf 350 µL zu erhöhen. Kapitel 12 beachten. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten

Plattenlayout die Verteilung bzw. Position der Proben und der Standards/Kontrollen (Doppelbestimmung empfohlen) genau

festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen.

Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen.

Für jeden Pipettierschritt der Standards/Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden.

Den Inkubator auf 37  1 °C einstellen.

1. Je 100 µL Standards/Kontrollen und vorverdünnte Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Vertiefung

A1 ist für den Substratleerwert vorgesehen.

2. Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.

3. 1 h ± 5 min bei 37 °C inkubieren.

4. Am Ende der Inkubationszeit Abdeckfolie entfernen und die Inkubationsflüssigkeit aus den Teststreifen absaugen.

Anschließend dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen vermeiden.

Das Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte > 5 sec betragen. Nach dem Waschen die Teststreifen auf

Fließpapier ausklopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.

Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falschen

Messergebnissen führt!

5. 100 µL Konjugat in alle Vertiefungen, mit Ausnahme der für die Berechnung des Leerwertes A1 vorgesehenen,

pipettieren.

6. 30 min bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen.

7. Waschvorgang gemäß Punkt 4 wiederholen.

8. 100 µL TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren.

9. Genau 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Bei enzymatischer Reaktion findet eine

Blaufärbung statt.

10. In alle Vertiefungen 100 µL Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei

Zugabe der TMB-Substratlösung pipettieren, dadurch erfolgt ein Farbwechsel von blau nach gelb.

11. Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopplösung

messen.

8.1. Messung

Mit Hilfe des Substratleerwertes den Nullabgleich des Mikrotiterplatten-Photometers vornehmen.

Falls diese Eichung aus technischen Gründen nicht möglich ist, muss nach der Messung der Extinktionswert des

Substratleerwertes von allen anderen Extinktionswerten subtrahiert werden, um einwandfreie Ergebnisse zu erzielen!

Extinktion aller Kavitäten bei 450 nm messen und die Messwerte der Standards/Kontrollen und Proben in das Plattenlayout

eintragen.

Eine bichromatische Messung mit der Referenzwellenlänge 620 nm wird empfohlen.

Falls Doppel- oder Mehrfachbestimmungen durchgeführt wurden, den Mittelwert der Extinktionswerte berechnen.

9. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

9.1. Testgültigkeitskriterien

Der Test wurde richtig durchgeführt, wenn er folgende Kriterien erfüllt:

▪ Substrat-Leerwert: Extinktionswert < 0,100

▪ Negativkontrolle: Extinktionswert < 0,200 und < Cut-off

▪ Cut-off Kontrolle: Extinktionswert 0,150 – 1,300

▪ Positivkontrolle: Extinktionswert > Cut-off

Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden.

9.2. Messwertberechnung

Der Cut-off ergibt sich aus dem Mittelwert der gemessenen Extinktionen der Cut-off Kontrolle.

Beispiel: 0,44 OD Cut-off Kontrolle + 0,42 OD Cut-off Kontrolle = 0,86: 2 = 0,43

Cut-off = 0,43

9.2.1. Ergebnisse in Einheiten [NTU]

Mittlere Extinktion der Probe x 10 = [NovaTec Einheiten = NTU]

Cut-off

Beispiel: 1,591 x 10 = 37 NTU

0,43

9.3. Interpretation der Ergebnisse

Normwert-Bereiche für diesen ELISA sollten, basierend auf dem entsprechenden Probenkollektiv im jeweiligen Einzugsgebiet,

individuell von jedem Labor erstellt werden.

Folgende Angaben gelten als Richtlinien:

Cut-off

10 NTU

Positiv

> 11 NTU

Es liegen Antikörper gegen den Erreger vor. Ein Kontakt mit dem Antigen

(Erreger bzw. Impfstoff) hat stattgefunden.

Grenzwertig

9 – 11 NTU

Antikörper gegen den Erreger können nicht eindeutig nachgewiesen werden.

Es wird empfohlen den Test nach 2 bis 4 Wochen mit einer frischen

Patientenprobe zu wiederholen. Finden sich die Ergebnisse erneut im

grenzwertigen Bereich, gilt die Probe als negativ.

Negativ

< 9 NTU

Es liegen keine Antikörper gegen den Erreger vor. Ein vorausgegangener

Kontakt mit dem Antigen (Erreger bzw. Impfstoff) ist unwahrscheinlich.

Die Diagnose einer Infektionskrankheit darf nicht allein auf der Basis des Ergebnisses einer Bestimmung gestellt werden.

Die anamnestischen Daten sowie die Symptomatologie müssen zusätzlich zu den serologischen Ergebnissen in Betracht

gezogen werden.

10. TESTMERKMALE

Die Ergebnisse beziehen sich auf die untersuchten Probenkollektive; es handelt sich nicht um garantierte Spezifikationen.

Die Leistungsdaten wurden mit caninen Proben bestimmt. Aufgrund der Eigenschaften des Protein A/G Konjugats sollte der

ELISA mit allen Proben von Säugetieren reagieren. Detailliertere Informationen sind auf Nachfrage erhältlich.

10.1. Präzision

Intraassay n Mittelwert (E) Vk (%)

0.463

4.25

1.245

5.95

0.727

3.59

Interassay n Mittelwert (NTU) Vk (%)

27.34

4.94

29.33

6.54

1.23

14.19

10.2. Diagnostische Spezifität

Die diagnostische Spezifität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein negatives Ergebnis bei Fehlen des

spezifischen Analyten zu liefern.

Diagnostische Spezifität canine: 95,43 % (95 % Konfidenzintervall: 91,19 % - 98,01 %)

10.3. Diagnostische Sensitivität

Die diagnostische Sensitivität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein positives Ergebnis bei Vorhandensein des

spezifischen Analyten zu liefern.

Diagnostische Sensitivität canine: 95,80 % (95 % Konfidenzintervall: 90,47 % - 98,62 %)

10.4. Interferenzen

Hämolytische, lipämische und ikterische Proben ergaben bis zu einer Konzentration von 10 mg/mL für Hämoglobin, von

5 mg/mL Triglyceride und von 0,5 mg/mL für Bilirubin keine Interferenzen im vorliegenden ELISA.

10.5. Kreuzreaktivität

Kreuzreaktionen, insbesondere Trypanosoma cruzi (Chagas), können nicht ausgeschlossen werden.

11. GRENZEN DES VERFAHRENS

Kontamination der Proben durch Bakterien oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der

Messwerte führen.

12. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE

▪ Nur für veterinärmedizinische in-vitro-Diagnostik.

▪ Alle Materialien menschlichen oder tierischen Ursprungs sind als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu

behandeln.

▪ Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAg nicht-reaktiv

getestet.

▪ Reagenzien und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen.

▪ Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden.

▪ Nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden.

▪ Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden.

▪ Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen, um Kreuzkontaminationen zur vermeiden.

▪ Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden.

▪ Nach dem ersten Öffnen Konjugat und Standards/Kontrollen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen.

▪ Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten, Reagenzien sorgfältig in die Kavitäten

pipettieren.

▪ Der ELISA ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei

beherrscht.

12.1. Sicherheitshinweis für Reagenzien, die Gefahrstoffe enthalten

Die Reagenzien können CMIT/MIT (3:1) oder MIT enthalten (siehe 4.1)

Daher gelten die folgenden Gefahren- und Sicherheitshinweise.

Achtung

H317

Kann allergische Hautreaktionen verursachen.

P261

Einatmen von Aerosol vermeiden.

P280

Schutzhandschuhe/Schutzkleidung tragen.

P302+P352

BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Seife und Wasser waschen.

P333+P313

Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe

hinzuziehen.

P362+P364

Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen

Weitere Informationen können dem Sicherheitsdatenblatt entnommen werden.

12.2. Entsorgungshinweise

Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen

Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von Sonderabfällen.

13. BESTELLINFORMATIONEN

Produktnummer: LEIVT0310 VetLine Leishmania ELISA (96 Bestimmungen)

BIBLIOGRAPHY / LITERATUR / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA /

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