VetLine Anaplasma, Elisa kit
96 Bestimmungen für Anaplasma
Art. Nr.:
ANAVT0850
Inhalt
Einheit(en)
Verkaufseinheit
Kit
Der VetLine Anaplasma ELISA ist für den qualitativen Nachweis spezifischer Antikörper gegen Anaplasma in veterinärem Serum bestimmt.
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DEUTSCH
1. EINLEITUNG
Anaplasmen sind bakterielle Erreger aus der Ordnung Rickettsiales. Die Bakterien leben in den Erythrozyten des Wirtes.
Anaplasma verursacht die Krankheit Anaplasmose. Diese ist aufgrund ihrer breiten Palette von Vektoren (Zecken) weltweit
verbreitet.
Anaplasmose oder Tick Borne Fever (TBF) ist eine Krankheit von Schafen und Rindern und verursacht Anämien und das
saisonale "Weidefieber". Es wird von Anaplasma phagocytophilum (früher bekannt als Ehrlichia phagocytophila) verursacht.
Saisonale Anaplasmose tritt bei Rindern auf, die im Frühjahr auf zeckenbelastete Weiden zurückgeführt werden. Anaplasmose
betrifft in erster Linie Schafe und Rinder, und weniger häufig Hirsche, Pferde und Hunde. Anaplasmose verursacht
multisystemische Krankheiten, verursacht Herz-Kreislauf-, Magen-Darm-, Atmungs-, Fortpflanzungs- und neurologische
Symptome, und auch Lymphadenopathie und Auszehrungskrankheit.
Antikörper können mit indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (IFAT), Komplement-Bindungs-Reaktion (KBR),
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Counterimmunelektrophorese (CIEP).
2. VERWENDUNGSZWECK
Der NovaTec VetLine Anaplasma ELISA ist für den qualitativen Nachweis spezifischer Antikörper gegen Anaplasma in
veterinärem Serum bestimmt.
3. TESTPRINZIP
Die qualitative immunenzymatische Bestimmung von spezifischen Antikörpern beruht auf der ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay) Technik.
Die Mikrotiterplatten sind mit spezifischen Antigenen beschichtet, an welche die korrespondierenden Antikörper aus der Probe
binden. Ungebundenes Probenmaterial wird durch Waschen entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe eines Meerettich-
Peroxidase (HRP) Konjugates. Dieses Konjugat bindet an die an der Mikrotiterplatte gebundenen spezifischen Antikörper. In
einem zweiten Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Die Immunkomplexe, die durch die Bindung des Konjugates
entstanden sind, werden durch die Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung und eine resultierende Blaufärbung
nachgewiesen.
Die Intensität des Reaktionsproduktes ist proportional zur Menge der spezifischen Antikörper in der Probe. Die Reaktion wird
mit Schwefelsäure gestoppt, wodurch ein Farbumschlag von blau nach gelb erfolgt. Die Absorption wird bei 450/620 nm mit
einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen.
4. MATERIALIEN
4.1. Mitgelieferte Reagenzien
▪ Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit Anaplasma Antigenen; in wieder verschließbarem
Aluminiumbeutel.
▪ Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche mit 100 mL Phosphatpuffer (10 mM) zur Probenverdünnung; pH 7,2 ± 0,2; gelb
gefärbt; gebrauchsfertig; weiße Verschlusskappe; ≤ 0,0015 % (v/v) CMIT/MIT (3:1).
▪ Stopplösung: 1 Flasche mit 15 mL Schwefelsäure, 0,2 mol/L; gebrauchsfertig; rote Verschlusskappe.
▪ Waschpuffer (20x konz.): 1 Flasche mit 50 mL eines 20-fach konzentrierten Phosphatpuffers (0,2 M), zum Waschen
der Kavitäten; pH 7,2 ± 0,2; weiße Verschlusskappe.
▪ Konjugat: 1 Flasche mit 20 mL Peroxidase-konjugierten Protein A/G; gelb gefärbt; gebrauchsfertig; weiße
Verschlusskappe; ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
▪ TMB-Substratlösung: 1 Flasche mit 15 mL 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin (TMB), < 0,1 %; gebrauchsfertig; gelbe
Verschlusskappe.
▪ Positivkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL; gelb gefärbt; rote Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
▪ Cut-off Kontrolle: 1 Fläschchen mit 3 mL; gelb gefärbt; grüne Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,02 % (v/v) MIT.
▪ Negativkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL; gelb gefärbt; blaue Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,0015 % (v/v)
CMIT/MIT (3:1).
Für Gefahren- und Sicherheitshinweise siehe 12.1.
Für potenzielle Gefahrstoffe überprüfen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt.
4.2. Mitgeliefertes Zubehör
▪ 1 selbstklebende Abdeckfolie
▪ 1 Arbeitsanleitung
▪ 1 Plattenlayout
4.3. Erforderliche Materialien und Geräte
▪ Mikrotiterplatten-Photometer mit Filtern 450/620 nm
▪ Inkubator 37°C
▪ Manuelle oder automatische Waschvorrichtung
▪ Mikropipetten (10 - 1000 µL)
▪ Vortex-Mischer
▪ Destilliertes Wasser
▪ Plastikröhrchen für den einmaligen Gebrauch
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5. STABILITÄT UND LAGERUNG
Testkit bei 2...8 °C lagern. Die geöffneten Reagenzien sind bis zu den auf den Etiketten angegebenen Verfallsdaten
verwendbar, wenn sie bei 2...8 °C gelagert werden.
6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Es ist sehr wichtig, alle Reagenzien und Proben vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur (20...25 °C) zu bringen
und zu mischen!
6.1. Mikrotiterplatte
Die abbrechbaren Streifen sind mit Anaplasma Antigenen beschichtet. Nicht verbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel
zusammen mit dem Trockenmittel sofort wieder verschließen und bei 2...8 °C lagern.
6.2. Waschpuffer (20x konz.)
Der Waschpuffer ist im Verhältnis 1 + 19 zu verdünnen; z.B. 10 mL Waschpuffer + 190 mL destilliertes Wasser.
Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur (20…25 °C) 5 Tage haltbar. Sollten Kristalle im Konzentrat auftreten, die Lösung
z.B. in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmen und vor dem Verdünnen gut mischen.
6.3. TMB-Substratlösung
Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist farblos, kann aber auch leicht
hellblau sein. Sollte die TMB-Substratlösung blau sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden.
7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Es sollten canine Serumproben verwendet werden. Werden die Bestimmungen innerhalb von 5 Tagen nach Blutentnahme
durchgeführt, können die Proben bei 2...8 °C aufbewahrt werden, sonst aliquotieren und tiefgefrieren (-70…-20 °C). Wieder
aufgetaute Proben vor dem Verdünnen gut schütteln. Wiederholtes Tiefgefrieren und Auftauen vermeiden!
Hitzeinaktivierung der Proben wird nicht empfohlen.
7.1. Probenverdünnung
Proben vor Testbeginn im Verhältnis 1 + 100 mit Probenverdünnungspuffer verdünnen, z. B. 10 µL Probe und 1 mL
Probenverdünnungspuffer in die entsprechenden Röhrchen pipettieren, um eine Verdünnung von 1 + 100 zu erhalten; gut
mischen (Vortex).
8. TESTDURCHFÜHRUNG
Arbeitsanleitung vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die
Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert. Beim Arbeiten mit
ELISA Automaten empfehlen wir, um Wascheffekte auszuschließen, die Zahl der Waschschritte von drei auf bis zu fünf und das
Volumen des Waschpuffers von 300 µL auf 350 µL zu erhöhen. Kapitel 12 beachten. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten
Plattenlayout die Verteilung bzw. Position der Proben und der Standards/Kontrollen (Doppelbestimmung empfohlen) genau
festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen.
Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen.
Für jeden Pipettierschritt der Standards/Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden.
Den Inkubator auf 37 1 °C einstellen.
1. Je 100 µL Standards/Kontrollen und vorverdünnte Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Vertiefung
A1 ist für den Substratleerwert vorgesehen.
2. Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.
3. 1 h ± 5 min bei 37 °C inkubieren.
4. Am Ende der Inkubationszeit Abdeckfolie entfernen und die Inkubationsflüssigkeit aus den Teststreifen absaugen.
Anschließend dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen vermeiden.
Das Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte > 5 sec betragen. Nach dem Waschen die Teststreifen auf
Fließpapier ausklopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falschen
Messergebnissen führt!
5. 100 µL Konjugat in alle Vertiefungen, mit Ausnahme der für die Berechnung des Leerwertes A1 vorgesehenen,
pipettieren.
6. 30 min bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen.
7. Waschvorgang gemäß Punkt 4 wiederholen.
8. 100 µL TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren.
9. Genau 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Bei enzymatischer Reaktion findet eine
Blaufärbung statt.
10. In alle Vertiefungen 100 µL Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei
Zugabe der TMB-Substratlösung pipettieren, dadurch erfolgt ein Farbwechsel von blau nach gelb.
11. Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopplösung
messen.
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8.1. Messung
Mit Hilfe des Substratleerwertes den Nullabgleich des Mikrotiterplatten-Photometers vornehmen.
Falls diese Eichung aus technischen Gründen nicht möglich ist, muss nach der Messung der Extinktionswert des
Substratleerwertes von allen anderen Extinktionswerten subtrahiert werden, um einwandfreie Ergebnisse zu erzielen!
Extinktion aller Kavitäten bei 450 nm messen und die Messwerte der Standards/Kontrollen und Proben in das Plattenlayout
eintragen.
Eine bichromatische Messung mit der Referenzwellenlänge 620 nm wird empfohlen.
Falls Doppel- oder Mehrfachbestimmungen durchgeführt wurden, den Mittelwert der Extinktionswerte berechnen.
9. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
9.1. Testgültigkeitskriterien
Der Test wurde richtig durchgeführt, wenn er folgende Kriterien erfüllt:
▪ Substrat-Leerwert: Extinktionswert < 0,100
▪ Negativkontrolle: Extinktionswert < 0,200 und < Cut-off
▪ Cut-off Kontrolle: Extinktionswert 0,150 – 1,300
▪ Positivkontrolle: Extinktionswert > Cut-off
Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden.
9.2. Messwertberechnung
Der Cut-off ergibt sich aus dem Mittelwert der gemessenen Extinktionen der Cut-off Kontrolle.
Beispiel: 0,44 OD Cut-off Kontrolle + 0,42 OD Cut-off Kontrolle = 0,86: 2 = 0,43
Cut-off = 0,43
9.2.1. Ergebnisse in Einheiten [NTU]
Mittlere Extinktion der Probe x 10 = [NovaTec Einheiten = NTU]
Cut-off
Beispiel: 1,591 x 10 = 37 NTU
0,43
9.3. Interpretation der Ergebnisse
Normwert-Bereiche für diesen ELISA sollten, basierend auf dem entsprechenden Probenkollektiv im jeweiligen Einzugsgebiet,
individuell von jedem Labor erstellt werden.
Folgende Angaben gelten als Richtlinien:
Cut-off
10 NTU
-
Positiv
> 11 NTU
Es liegen Antikörper gegen den Erreger vor. Ein Kontakt mit dem Antigen
(Erreger bzw. Impfstoff) hat stattgefunden.
Grenzwertig
9 – 11 NTU
Antikörper gegen den Erreger können nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Es wird empfohlen den Test nach 2 bis 4 Wochen mit einer frischen
Patientenprobe zu wiederholen. Finden sich die Ergebnisse erneut im
grenzwertigen Bereich, gilt die Probe als negativ.
Negativ
< 9 NTU
Es liegen keine Antikörper gegen den Erreger vor. Ein vorausgegangener
Kontakt mit dem Antigen (Erreger bzw. Impfstoff) ist unwahrscheinlich.
Die Diagnose einer Infektionskrankheit darf nicht allein auf der Basis des Ergebnisses einer Bestimmung gestellt werden.
Die anamnestischen Daten sowie die Symptomatologie müssen zusätzlich zu den serologischen Ergebnissen in Betracht
gezogen werden.
10. TESTMERKMALE
Die Ergebnisse beziehen sich auf die untersuchten Probenkollektive; es handelt sich nicht um garantierte Spezifikationen.
Die Leistungsdaten wurden mit caninen Proben bestimmt. Aufgrund der Eigenschaften des Protein A/G Konjugats sollte der
ELISA mit allen Proben von Säugetieren reagieren. Detailliertere Informationen sind auf Nachfrage erhältlich.
10.1. Präzision
Intraassay n Mittelwert (E) Vk (%)
#1
24
0.717
2.92
#2
24
0.705
2.73
#3
24
0.259
2.63
Interassay n Mittelwert (NTU) Vk (%)
#1
12
11.61
7.55
#2
12
15.93
9.91
#3
12
6.84
10.40
9
10.2. Diagnostische Spezifität
Die diagnostische Spezifität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein negatives Ergebnis bei Fehlen des
spezifischen Analyten zu liefern.
Diagnostische Spezifität canine: 94,12 % (95 % Konfidenzintervall: 71,31 % - 99,85 %)
10.3. Diagnostische Sensitivität
Die diagnostische Sensitivität ist definiert als die Wahrscheinlichkeit des Tests, ein positives Ergebnis bei Vorhandensein des
spezifischen Analyten zu liefern.
Diagnostische Sensitivität canine: 92,00 % (95 % Konfidenzintervall: 73,97 % - 99,02 %)
10.4. Interferenzen
Hämolytische, lipämische und ikterische Proben ergaben bis zu einer Konzentration von 10 mg/mL für Hämoglobin, von
5 mg/mL Triglyceride und von 0,5 mg/mL für Bilirubin keine Interferenzen im vorliegenden ELISA.
10.5. Kreuzreaktivität
Kreuzreaktionen können nicht ausgeschlossen werden.
11. GRENZEN DES VERFAHRENS
Kontamination der Proben durch Bakterien oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der
Messwerte führen.
12. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE
▪ Nur für veterinärmedizinische in-vitro-Diagnostik.
▪ Alle Materialien menschlichen oder tierischen Ursprungs sind als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu
behandeln.
▪ Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAg nicht-reaktiv
getestet.
▪ Reagenzien und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen.
▪ Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden.
▪ Nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden.
▪ Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden.
▪ Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen, um Kreuzkontaminationen zur vermeiden.
▪ Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
▪ Nach dem ersten Öffnen Konjugat und Standards/Kontrollen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen.
▪ Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten, Reagenzien sorgfältig in die Kavitäten
pipettieren.
▪ Der ELISA ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei
beherrscht.
12.1. Sicherheitshinweis für Reagenzien, die Gefahrstoffe enthalten
Die Reagenzien können CMIT/MIT (3:1) oder MIT enthalten (siehe 4.1)
Daher gelten die folgenden Gefahren- und Sicherheitshinweise.
Achtung
H317
Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
P261
Einatmen von Aerosol vermeiden.
P280
Schutzhandschuhe/Schutzkleidung tragen.
P302+P352
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Seife und Wasser waschen.
P333+P313
Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe
hinzuziehen.
P362+P364
Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen
Weitere Informationen können dem Sicherheitsdatenblatt entnommen werden.
12.2. Entsorgungshinweise
Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen
Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von Sonderabfällen.
13. BESTELLINFORMATIONEN
Produktnummer: ANAVT0850 VetLine Anaplasma ELISA (96 Bestimmungen)
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BIBLIOGRAPHY / LITERATUR / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA /
BIBLIOGRAFIA
Miert, A. S. J. P. A. Mvan., Duin, C. T. Mvan., Schotman, A. J. H., Franssen, F. F. (1984) Clinical, haematological and blood
biochemical changes in goats after experimental infection with tick-borne fever. Vet Parasitology, 16(3/4):225-233; 29
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Pantchev N, Schaper R, Limousin S, Norden N, Weise M, Lorentzen L. Occurrence of Dirofilaria immitis and tick-borne
infections caused by Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdorferi sensu lato and Ehrlichia canis in domestic dogs in
France: results of a countrywide serologic survey. Parasitol Res. 2009 Aug;105 Suppl 1:S101-14.
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Dumler JS et al.: Human Granulocytic Anaplasmosis and Anaplasma phagocytophilum. Medscape.com (2005)
ABBREVIATIONS / ABKÜRZUNGEN / ABRÉVIATIONS / ABBREVIAZIONI / ABREVIACIÓNES /
ABREVIATURAS
CMIT
5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one
MIT
2-methyl-2H-isothiazol-3-one
SUMMARY OF TEST PROCEDURE / KURZANLEITUNG TESTDURCHFÜHRUNG / RÉSUMÉ DE LA PROCEDURE DE TEST / SCHEMA DELLA PROCEDURA / RESUMEN DE LA TÉCNICA / RESUMO DO PROCEDIMENTO DE TESTE
SCHEME OF THE ASSAY
VetLine Anaplasma ELISA
Test Preparation
Prepare reagents and samples as described.
Establish the distribution and identification plan for all samples and standards/controls on the plate
layout supplied in the kit.
Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.
Assay Procedure
| Substrate Blank (A1) |
Negative Control | Cut-off Control | Positive Control | Sample (diluted 1+100) |
|
|---|---|---|---|---|---|
| Negative Control | - | 100 µL | - | - | - |
| Cut-off Control | - | - | 100 µL | - | - |
| Positive Control | - | - | - | 100 µL | - |
| Sample (diluted 1+100) |
- | - | - | - | 100 µL |
|
Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 1 h at 37±1 °C Wash each well three times with 300 µL of Washing Buffer |
|||||
| Conjugate | - | 100 µL | 100 µL | 100 µL | 100 µL |
|
Incubate for 30 min at room temperature (20...25 °C) Do not expose to direct sunlight Wash each well three times with 300 µL of Washing Buffer |
|||||
| TMB Substrate Solution | 100 µL | 100 µL | 100 µL | 100 µL | 100 µL |
| Incubate for exactly 15 min at room temperature (20...25 °C) in the dark | |||||
| Stop Solution | 100 µL | 100 µL | 100 µL | 100 µL | 100 µL |
| Photometric measurement at 450 nm (reference wavelength: 620 nm) | |||||
ANAVT0850 engl,dt,fr,es 17092020-TL
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