THEILERIA EQUI ANTIBODY TEST KIT, cELISA

Anweisungen für den Test zum Katalognummer 274-2

Allgemeine Beschreibung

Dieser kompetitive, enzymgebundene Immunosorbent-Assay (cELISA) weist Antikörper gegen Theileria equi in Pferdeseren nach. Der T. equi-Antikörper im Proben-Serum hemmt die Bindung des primären monoklonalen Antikörpers. Die Bindung des primären monoklonalen Antikörpers an die mit Antigen beschichtete Platte wird mit einem mit Meerrettichperoxidase (HRP) markierten sekundären Antikörper nachgewiesen. Schließlich wird das Vorhandensein des HRP-markierten sekundären Antikörpers durch Zugabe eines Enzymsubstrats und anschließende Farbentwicklung quantifiziert. Eine starke Farbentwicklung deutet auf eine geringe oder keine Hemmung der Bindung des primären monoklonalen Antikörpers und somit auf das Fehlen von T. equi-Antikörpern im Proben-Serum hin. Eine schwache Farbentwicklung aufgrund der Hemmung der Bindung des primären monoklonalen Antikörpers an das Antigen auf der festen Phase deutet auf das Vorhandensein von T. equi-Antikörpern im Proben-Serum hin.

Kit Inhalt

Benötigte, aber nicht im Testkit enthaltene Materialien

Ein- und Mehrkanal-Pipettiergeräte mit einstellbarem Volumen und Einweg-Pipettenspitzen, nicht antigenbeschichtete Übertragungsplatten, ELISA-Mikrotiterplatten-Lesegerät mit Absorptionsmessung bei 620, 630 oder 650 nm, ELISA-Mikrotiterplatten-Lesegerät mit Absorptionsmessung bei 620, 630 oder 650 nm, Papiertücher, Messzylinder, Timer, Reservoirs für Mehrkanalpipetten, Waschflasche, Manuelle Mehrkanalwascheinrichtung oder automatische Plattenwaschanlage

Lagerung und Stabilität

Lagern Sie alle Reagenzien bei 2–8 °C. Nicht einfrieren. Bei sachgerechter Lagerung bleiben die Reagenzien bis zum Verfallsdatum stabil. Verwenden Sie das Testkit nicht nach dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum.

Vorbereitung

1. a)Reagenzien temperieren: Bringen Sie die Serumproben, Reagenzien und Platten vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur (23 ± 2 °C). 

2. b)Vorbereitung von Kontrollen und Proben: die Positiv- und Negativ-Kontrollen (B und C) sowie die zu testenden Serumproben müssen für diesen Test im Verhältnis 1:2 im Serum-Verdünnungspuffer (G) verdünnt werden. Es wird empfohlen, diese Verdünnungen in einer nicht antigenbeschichteten Übertragungsplatte 

   vorzunehmen. Fügen Sie entsprechend Ihrem Versuchsprotokoll Serum-Verdünnungspuffer (G) in die entsprechenden Vertiefungen der Übertragungsplatte hinzu. Geben Sie jeweils das gleiche Volumen der Positivkontrolle (B), Negativkontrolle (C) oder der Probe in die jeweiligen Vertiefungen und mischen Sie durch mindestens dreimaliges Pipettieren mit einem Multikanal-Pipettiergerät. Wechseln Sie die Spitzen zwischen den Proben.Das Volumen in der Übertragungsplatte muss mindestens 50 μl überschreiten, um jeweils 50 μl für die Weitergabe entnehmen zu können.Laden Sie die Positivkontrolle (B) stets in Duplikaten und die Negativkontrolle (C) in Triplikaten, unabhängig von der Anzahl der zu testenden Serumproben. Bei Verwendung ganzer Platten ist es empfehlenswert, die Kontrollen in verschiedenen Bereichen der Platte zu platzieren. Die Kontrollen müssen bei jedem Durchlauf des Assays und auf jeder Platte bei Verwendung mehrerer Platten geladen werden 

3. c)Vorbereitung der Platte(n): Entnehmen Sie die Platte(n) aus dem Folienbeutel (A). Falls zutreffend, geben Sie nicht verwendete Streifen zurück in den Beutel und verschließen Sie diesen sorgfältig wieder luftdicht. Legen Sie die zu verwendenden Streifen in den Rahmen und nummerieren Sie die Oberseite jedes Streifens, um die Orientierung während des Versuchs zu gewährleisten. Markieren Sie die Streifen immer, falls sie sich während der Waschvorgänge aus dem Rahmen lösen sollten. 

4. d)Vorbereitung des Primärantikörpers: bereiten Sie den 1-fach Primärantikörper vor, indem Sie 1 Teil des 100-fach konzentrierten Primärantikörpers (D) mit 99 Teilen Antikörper-Verdünnungspuffer (F) mischen.Beispiel: Für 96 Vertiefungen mischen Sie 60 µl des 100-fach Primärantikörpers (D) mit 5,940 ml Antikörper-Verdünnungspuffer (F), um 6 ml 1-fach Primärantikörper herzustellen. Pro Vertiefung werden 50 µl benötigt. Planen Sie eine zusätzliche Menge für Reservoirs, Leitungen, Pipettieren etc. ein. 

5. e)Vorbereitung des sekundären Antikörpers mit Peroxidase-Konjugat: bereiten Sie den 1-fach sekundären Antikörper-Peroxidase-Konjugat vor, indem Sie 1 Teil des 100-fach konzentrierten sekundären Antikörper-Peroxidase-Konjugats (E) mit 99 Teilen Antikörper-Verdünnungspuffer (F) mischen.Beispiel: Für 96 Vertiefungen mischen Sie 60 µl des 100-fach sekundären Antikörper-Peroxidase-Konjugats (E) mit 5,940 ml Antikörper-Verdünnungspuffer (F), um 6 ml 1-fach sekundären Antikörper-Peroxidase-Konjugat herzustellen. Pro Vertiefung werden 50 µl benötigt. Planen Sie eine zusätzliche Menge für Reservoirs, Leitungen, Pipettieren etc. ein. 

6. f)Vorbereitung der Waschlösung: Bereiten Sie die 1-fach Waschlösung vor, indem Sie 1 Teil des 10-fach Waschlösungskonzentrats (H) mit 9 Teilen entionisiertem oder destilliertem Wasser verdünnen. Pro Vertiefung werden ca. 1,8 ml benötigt. Planen Sie eine zusätzliche Menge für Reservoirs, Leitungen, Pipettieren etc. ein. 

Testdurchführung

1. 1.Kontrollen und Serumproben auftragen: mit einem auf 50 µl eingestellten Pipettierer verdünnte Kontrollen und Serumproben in die antigenbeschichtete Platte (A) übertragen. Die Proben und Kontrollen sollten so schnell wie möglich auf die Platte aufgetragen werden. Pipettenspitzen zwischen den Proben wechseln. Klopfen Sie mehrmals an die Seite der Platte, damit die Proben den Plattenboden benetzen. Achten Sie darauf, dass keine Proben zwischen die Vertiefungen verschüttet werden. Die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 2 °C) inkubieren. 

2. 2.Waschen der Wells: nach der 30-minütigen Inkubation die Platte dreimal waschen: 

   Bei automatischem Waschgerät die Platte auflegen und dreimal mit 1-fach Waschlösung füllen und waschen. 

   Bei manuellem Waschen den Inhalt der Vertiefungen ausschütten und restliche Proben entfernen, indem die umgedrehte Platte viermal auf ein sauberes Papiertuch geschlagen wird, wobei jedes Mal eine andere Stelle des Tuchs benutzt wird. Anschließend jede Vertiefung sofort mit 1-fach Waschlösung füllen (z. B. mit Mehrkanalfüller oder Waschflasche). Die Waschlösung ausgießen und die Platte erneut kräftig auf ein sauberes Papiertuch schlagen. Diesen Füll- und Leer-Vorgang zwei weitere Male wiederholen, insgesamt also drei Waschzyklen. 

3. 3.Primärantikörper hinzufügen: jeweils 50 µl des verdünnten (1-fach) Primärantikörpers zugeben. Klopfen Sie an die Platte, damit der Antikörper den Boden der Vertiefungen benetzt. 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 2 °C) inkubieren. 

4. 4.Vertiefungen waschen: wie unter Schritt 2 beschrieben, dreimal waschen. 

5. 5.Sekundärantikörper-Peroxidase-Konjugat zugeben: jeweils 50 µl des verdünnten (1-fach) sekundären Antikörper-Peroxidase-Konjugats zugeben. Platte klopfen, um den Konjugat-Belag im Wellensboden zu gewährleisten. 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 2 °C) inkubieren. 

6. 6.Vertiefungen waschen: wie unter Schritt 2 beschrieben, dreimal waschen. 

7. 7.Substratlösung zugeben: jeweils 50 µl der Substratlösung (I) zugeben. Platte klopfen, damit die Lösung den Boden benetzt. 15 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 2 °C) inkubieren. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Vertiefungen nicht entleeren. 

8. 8. Stopp-Lösung zugeben: jeweils 50 µl der Stopp-Lösung (J) zugeben. Platte klopfen, um Substrat und Stopp-Lösung gut zu vermischen. Vertiefungen nicht entleeren. 

9. 9.Testergebnisse messen und dokumentieren: unmittelbar nach Zugabe der Stopp-Lösung die Platte mit einem Mikrotiterplatten-Absorptionsspektrophotometer auslesen. Die Messwellenlänge auf 620, 630 oder 650 nm einstellen. Bei Geräten, die eine reine Referenzvertiefung benötigen, diese ohne Reagenzien belassen. 

    

Berechnung der prozentualen Hemmung (% Inhibition): (%I):

% Inhibition (%I) = 100 [1-(Sample OD ÷ NC OD)]

Testvalidierung

• •Der Mittelwert der Negativkontrollen muss eine optische Dichte (OD) von ≥ 0,300 und ≤ 2,000 aufweisen. 

• •Der Mittelwert der Positivkontrollen muss eine Hemmung von ≥ 40% zeigen. 

Interpretation der Ergebnisse

• •    Zeigt eine Testprobe eine Hemmung von ≥ 40%, gilt sie als positiv. 

• •    Zeigt eine Testprobe eine Hemmung von < 40%, gilt sie als negativ. 

Vorsichtsmaßnahmen

Die Kit-Komponenten sind als potenziell gefährlich zu behandeln und zu entsorgen.Essen, Trinken und Rauchen ist in Bereichen, in denen Serumproben oder Kit-Reagenzien gehandhabt werden, strengstens untersagt. Pipettieren Sie niemals mit dem Mund. Einige Reagenzien können bei Verschlucken gesundheitsschädlich sein. Suchen Sie im Fall einer oralen Aufnahme sofort ärztliche Hilfe auf.Verwenden Sie keine abgelaufenen oder kontaminierten Reagenzien sowie keine Reagenzien aus anderen Kits oder Chargen. Mischen Sie keine Reagenzien unterschiedlicher Chargen desselben Produkts.

Komponente B (Positivkontrolle) enthält Natriumazid als Konservierungsmittel.

Komponente C (Negativkontrolle) enthält Natriumazid als Konservierungsmittel.

Komponente D (100X Primärantikörper) enthält ProClin™ 300, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan als Konservierungsmittel.

Komponente E (100X Sekundärantikörper-Peroxidase-Konjugat) enthält ProClin™ 300, Methylisothiazolon, Bromonitrodioxan und Thimerosal als Konservierungsmittel.

Komponente F (Antikörper-Verdünnungspuffer) enthält ProClin™ 300, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan als Konservierungsmittel.

Komponente G (Serum-Verdünnungspuffer) enthält Natriumazid als Konservierungsmittel.

Komponente J (Stopp-Lösung) enthält Natriumfluorid.

Version: 170803

Diese Übersetzung wurde aus dem Originaltext angefertigt. Bitte beziehen Sie sich stets auf das Originaldokument, da diese Übersetzung lediglich der Vereinfachung und Verständlichkeit in deutscher Sprache dient.

I. Alzaga - PIA Diagnostika e.U.	0043 670 703 6122
Auweg 9, 6972 Fussach (Austria)	info@piadiagnostika.com
Firmenbuch FN 589808s │ LG: Feldkirch	https://piadiagnostika.com