Symmetric Dimethylarginine (SDMA), Elisa Kit

Gebrauchsanweisung

SDMA vet ELISA

Enzymimmunoassay für die Quantitative Bestimmung von Endogenem symmetrischen Dimethyl-Arginin (SDMA) in Serum oder EDTA-Plasma von Hund und Katze

Nur für veterinärmedizinische Diagnostik

REF	EA203/96
	12 * 8
	2 - 8 °C

sdmavet-d_15.docx 2025-01-10

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung und Testprinzip 3
• 2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4
• 3. Lagerung und Haltbarkeit 5
• 4. Inhalt des Kits 5
• 5. Probengewinnung 7
• 6. Vorbereitung der Proben und Reagenzien 7
• 7. Testdurchführung 9
• 8. Testauswertung 11
• 9. Testcharakteristika 12
• 10. Literatur 19
• 11. Änderungen 19
• Pipettierschema - Probenvorbereitung 20
• Pipettierschema - ELISA 20

Gefahrensymbole

1. Einleitung und Testprinzip

SDMA (symmetrisches Dimethylarginin) identifiziert eine Nierenerkrankung bereits bei einem Verlust der Nierenfunktion von etwa 30-40%. Eine Erhöhung der Kreatininkonzentration tritt erst dann ein, wenn etwa 75% der Nephrone nicht mehr funktionsfähig sind. Somit ist SDMA im Gegensatz zu Kreatinin ein weitaus sensiblerer Biomarker für die Beurteilung der Nierenfunktion bei Hund und Katze. Unser SDMA ELISA ist schnell und präzise. Der für die Routine geeignete Test liefert SDMA-Werte in weniger als 3 Stunden. Er ist damit für die schnelle Diagnose erhöhter SDMA-Spiegel bei der Beurteilung der Nierenfunktion im Serum und Plasma geriatrischer Hunde und Katzen geeignet. SDMA ist immer im Zusammenhang mit Kreatinin und den Ergebnissen der Urinuntersuchung, insbesondere des spezifischen Harngewichts, zu beurteilen.

Erkrankungen der Niere sind bei älteren Hunden und Katzen sehr häufig anzutreffen und haben schwerwiegende gesundheitliche Folgen. Im Laufe des Lebens entwickelt eine von drei Katzen und einer von zehn Hunden eine Nierenerkrankung.

SDMA ist eine methylierte Form der Aminosäure Arginin, die nach Proteolyse eines intranukleären Proteins von allen kernhaltigen Zellen in die Zirkulation freigesetzt wird. Es wird zu mehr als 90% glomerulär filtriert und renal eliminiert. SDMA ist damit spezifisch für die Nierenfunktion. Dabei ist SDMA unabhängig von der Muskelmasse und eignet sich deshalb auch gut für das Monitoring alter und minderbemuskelter Tiere mit chronischer Nierenerkrankung.

Der SDMA-ELISA-Kit enthält Reagenzien für die quantitative Bestimmung von derivatisiertem SDMA in Plasma und Serum von Hund oder Katze. Die Derivatisierung erfolgt während der Probenvorbereitung. Dabei wird SDMA durch das Acylierungsreagenz quantitativ in N-Acyl-SDMA umgewandelt.Der SDMA-ELISA ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay. An die Festphase gebundenes und freies, in Lösung befindliches Antigen konkurrieren um eine definierte Anzahl von Antikörper-Bindungsstellen.

Wenn sich das System im Gleichgewicht befindet, wird der nicht-gebundene Antigen-Antikörper-Komplex in einem Waschschritt entfernt und der entsprechend gebundene Komplex mittels eines Peroxidase-Konjugats nachgewiesen und über den Umsatz von Tetramethylbenzidin (TMB) bestimmt. Die TMB/POD-Reaktion wird gestoppt und bei 450 nm gemessen.

Die Konzentration des an die Festphase gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexes ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.

2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

• Nur für Veterinärmedizinische Diagnostik. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal.
• Vor der Testdurchführung sollte die Gebrauchsanweisung vollständig gelesen und deren Inhalt verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden.
• Alle Reagenzien dieses Kits, die tierischen Ursprungs sind, stammen von gesunden Tieren. Die Reagenzien sollten trotzdem wie potentiell infektiöses Material behandelt werden.
• Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Kits sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten und Lagerbedingungen sind zu beachten.
• Beim Handhaben der Reagenzien, Kontrollen und Proben sind die gängigen Laborsicherheitsrichtlinien und die Gute Laborpraxis zu beachten.
• Während der Testdurchführung Kittel, Einmal-Handschuhe und Schutzbrille tragen.
• Ein Teil der Komponenten dieses Kits enthalten Gefahrstoffe und sind kennzeichnungspflichtig. Diese Komponenten tragen das entsprechende Gefahrensymbol auf ihrem Etikett. Weitere Informationen befinden sich in 4. Inhalt des Kits und auf den entsprechenden Sicherheitsdatenblättern.
• Vermeiden Sie alle Handlungen, die zu einem Verschlucken, Einatmen oder Injizieren der Reagenzien führen könnten. Niemals mit dem Mund pipettieren.
• Kontakt mit einzelnen Reagenzien vermeiden.
• Abfälle sollten nach den staatlichen und örtlichen Umweltschutzregularien entsorgt werden.
• Zerbrochenes Glas kann zu Verletzungen führen. Vorsicht bei Glasgefäßen.

3. Lagerung und Haltbarkeit

Der Kit wird bei Umgebungstemperatur geliefert und ist anschließend bei Lagerung zwischen 2 - 8 °C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach Anbruch ist der Kit bis zum Verfallsdatum haltbar. Die Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Reagenzien ist auf dem jeweiligen Flaschenetikett angegeben. Die Haltbarkeit und die Lagerung der vorbereiteten Reagenzien werden unter 6. geregelt.

Die Reagenzien müssen vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur gebracht und sofort nach Gebrauch wieder kühl gestellt werden.

4. Inhalt des Kits

Standard	1	2	3	4	5	6
µmol/l	0	0,2	0,4	0,7	1,2	3
ng/ml	0	40	81	141	242	606

Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten):

• Pipetten für 20, 50, 100 und 200 µl
• Mehrkanalpipette oder Waschgerät
• Multipette
• Destilliertes Wasser
• Mikrotiterplattenphotometer (450 nm)
• Horizontalschüttler, Rollmischer
• Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr

5. Probengewinnung

Für den Test kann EDTA-Plasma und Serum eingesetzt werden. Die Proben können bis zu 6 Stunden bei 2 – 8 °C gelagert werden. Proben, die nicht sofort in dem Test eingesetzt werden, können bei -20 °C mindestens 18 Monate gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.

6. Vorbereitung der Proben und Reagenzien

6.1 Mikrotiterstreifen

Mikrotiterstreifen STRIPS im geschlossenen Folienbeutel in etwa 10 Minuten auf Raumtemperatur bringen. Die nicht benötigten Mikrotiterstreifen dem Halterahmen entnehmen, wieder in den Beutel legen (das Trockenmittel im Beutel belassen) und diesen sorgfältig verschließen.

6.2 Ausgleichsreagenz

Inhalt des Fläschchens EQUA-REAG mit 21 ml destilliertem Wasser lösen, kurz vortexen und mindestens 20 Minuten auf den Rollmischer oder ähnlichem Schüttler mischen, übermäßige Schaumbildung vermeiden.

Das gelöste Ausgleichsreagenz muss für den späteren Gebrauch bei -20 °C eingefroren werden und bleibt so bis zum Verfallsdatum verwendbar.

6.3 Waschpuffer

Inhalt des Fläschchens WASH (20 ml) mit destilliertem Wasser auf 1.000 ml auffüllen, kurz mischen.

Der verdünnte Waschpuffer muss bei 2 – 8 °C gelagert werden und bleibt so für 4 Wochen verwendbar. Wird der Kit in mehreren Ansätzen verwendet, sollte nur die dafür benötigte Menge Waschpuffer angesetzt werden.

6.4 Acylierungs-Reagenz

Inhalt des Fläschchens ACYL-REAG mit 3 ml Solvent SOLVENT lösen und mindestens 10 Minuten auf den Rollenmischer oder ähnlichem Schüttler mischen. Das Acylierungsreagenz sollte unmittelbar vor Testbeginn frisch angesetzt werden und ist dann mind. 3 Stunden stabil. Durch die 2. und 3. Flasche im Kit ist der ELISA in zwei oder drei Ansätzen teilbar. Wenn der Kit in einem Ansatz verbraucht wird, den aufgelösten Inhalt von zwei Fläschchen poolen. Nach Gebrauch ist das Restreagenz zu verwerfen.

Alle anderen Reagenzien sind gebrauchsfertig.

7. Testdurchführung

Die Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen.

7.1 Probenvorbereitung (Acylierung)

Die für die Acylierung verwendeten Vertiefungen der Reaktionsplatte ACYL-PLATE markieren (Edding) und nicht noch einmal verwenden!

• 1. 20 µl Standard 1–6 CAL 1–6, Kontrolle 1 & 2 CON 1 & 2, Plasma und Serum in die entsprechenden Vertiefungen der Reaktionsplatte ACYL-PLATE pipettieren.
• 2. 20 µl Acylierungspuffer ACYL-BUFF in jede Vertiefung pipettieren.
• 3. 200 µl gelöstes Ausgleichsreagenz EQUA-REAG (s. 6.2) in jede Vertiefung pipettieren.

7.2 Durchführung ELISA

• 1. 20 µl acylierte Standards, Kontrollen und Proben von der Reaktionsplatte in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterstreifen STRIPS pipettieren.
• 2. 50 µl Antiserum AS in jede Vertiefung pipettieren.
• 3. Platte mit Haftklebefolie FOIL abkleben und 90 Minuten bei Raumtemperatur (20 – 25 °C) auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen.
• 4. Vertiefungen entleeren, mit ca. 300 µl verdünntem Waschpuffer WASH (s. 6.3) pro Vertiefung füllen und wieder entleeren. Anschließend die Mikrotiterstreifen umgedreht auf eine saugfähige Unterlage (Papiertuch) legen und kurz ausklopfen, um alle Flüssigkeitsreste zu entfernen. Diesen Vorgang insgesamt 4 mal durchführen. Alternativ kann auch ein Waschgerät verwendet werden.
• 5. 100 µl Enzymkonjugat CONJ in jede Vertiefung pipettieren.
• 6. 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen.
• 7. Waschen: wie unter Punkt 4. beschrieben.
• 8. 100 µl Substrat SUB in jede Vertiefung pipettieren.
• 9. 25 ± 5 Minuten bei Raumtemperatur (2 25 °C) auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen.
• 10. 100 µl Stopplösung STOP in jede Vertiefung pipettieren, mindestens 10 Sekunden auf einem Horizontalschüttler bei mittlerer Schüttelfrequenz mischen.
• 11. Platte im Photometer bei 450 nm (Referenzwellenlänge zwischen 570 nm und 650 nm) innerhalb von 15 Minuten messen.

8. Testauswertung

Standard	1	2	3	4	5	6
µmol/l	0	0,2	0,4	0,7	1,2	3
ng/ml	0	40	81	141	242	606

Umrechnung: SDMA: 1 µmol/l = 202 ng/ml = 20,2 µg/dl

Die ODs (optische Dichten) der Standards (linear) werden gegen die entsprechenden Konzentrationen der Standards (logarithmisch) aufgetragen.

Bei Verwendung eines Computerprogramms wird die 4-Parameter-Analyse empfohlen (Alternativ: Cubic-Spline oder Logit-Log).

Die Konzentrationen der Kontrollen und Proben können direkt aus der Standardkurve in µmol / l abgelesen werden.

Die Abbildung zeigt ein typisches Beispiel:

Qualitätskontrolle: Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn die Kitkontrollen innerhalb der Bereiche entsprechend des Qualitätskontrollzertifikates liegen. Ansonsten sollte der Test wiederholt werden.

9. Testcharakteristika

9.1 Referenzbereiche

Erwartete Werte (Serum, EDTA-Plasma)

Hund: 0,30 – 0,65 µmol/l (6,0 – 13 µg/dl)

Katze: 0,30 – 0,75 µmol/l (6,0 – 15 µg/dl)

Der angegebene Referenzbereich gilt lediglich als Richtlinie. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche erstellt.

9.2 Sensitivität

0,03 µmol/l (0,6 µg/dl)

9.3 Wiederfindung

9.3.1 Wiederfindung Katze

Unterschiedliche Mengen an SDMA wurden zu einem Serumpool von Katzen gegeben und anschließend im ELISA gemessen. Die analytische Wiederfindung von SDMA wurde bei 10 verschiedenen Konzentrationen aus den theoretisch erwarteten und den praktisch gemessenen Werten ermittelt. Die mittlere Wiederfindung für alle Konzentrationen der Serumprobe betrug 101 %.

zugesetzt [µmol/l]	gemessen [µmol/l]	erwartet [µmol/l]	% Wiederfindung
0,00	0,58
0,12	0,68	0,70	97
0,24	0,77	0,82	91
0,35	0,86	0,93	92
0,45	0,91	1,03	88
0,55	0,99	1,13	88
0,65	1,24	1,23	101
0,77	1,71	1,35	127
1,04	1,90	1,62	117
1,35	1,95	1,93	101
1,65	2,29	2,23	103
		Mittelwert	101

9.3.2 Wiederfindung Hund

Unterschiedliche Mengen an SDMA wurden zu einem Serumpool von Hunden gegeben und anschließend im ELISA gemessen. Die analytische Wiederfindung von SDMA wurde bei 10 verschiedenen Konzentrationen aus den theoretisch erwarteten und den praktisch gemessenen Werten ermittelt. Die mittlere Wiederfindung für alle Konzentrationen der Serumprobe betrug 104 %.

zugesetzt [µmol/l]	gemessen [µmol/l]	erwartet [µmol/l]	% Wiederfindung
0,00	0,54
0,12	0,74	0,66	112
0,24	0,74	0,78	95
0,35	0,86	0,89	97
0,45	0,94	0,99	95
0,55	1,01	1,09	93
0,65	1,19	1,18	101
0,77	1,51	1,31	115
1,04	1,73	1,58	109
1,35	2,19	1,89	116
1,65	2,23	2,19	102
		Mittelwert	104

9.4 Linearität

9.4.1 Linearität Katze

Die Linearität des ELISAs wurde durch Verdünnen einer aufgestockten Serumprobe von der Katze mit Wasser bestimmt. Die mittlere Linearität aller 7 Verdünnungen betrug in der Serumprobe 96%.

Verdünnung	Messwert [µmol/l]	extrapolierter Ausgangswert [µmol/l]	Wiederfindung %
orig.	2,09
4 + 1	1,73	2,16	103
2 + 1	1,30	1,95	93
1 + 1	0,95	1,90	91
1 + 2	0,59	1,77	85
1 + 3	0,52	2,08	100
1 + 5	0,33	1,98	95
1 + 7	0,28	2,24	107
		mittlere Wiederfindung	96

9.4.2 Linearität Hund

Die Linearität des ELISAs wurde durch Verdünnen einer aufgestockten Serumprobe vom Hund mit Wasser bestimmt. Die mittlere Linearität aller 7 Verdünnungen betrug in der Serumprobe 92%.

Verdünnung	Messwert [µmol/l]	extrapolierter Ausgangswert [µmol/l]	Wiederfindung %
orig.	1,88
4 + 1	1,30	1,63	87
2 + 1	1,21	1,82	97
1 + 1	0,92	1,84	98
1 + 2	0,59	1,77	94
1 + 3	0,43	1,72	91
1 + 5	0,28	1,68	89
1 + 7	0,20	1,60	85
		mittlere Wiederfindung	92

9.5 Spezifität (Kreuzreaktivitäten)

Der in dem Test verwendete Antikörper ist spezifisch für SDMA. Getestet wurden die Kreuzreaktivitäten zu Arginin, Homoarginin, Monomethylarginin (NMMA) und ADMA.

Substanz	ED-50-Wert [µmol/l]	Kreuzreaktivität [%]
SDMA	1,39	100
ADMA	84	1,2
NMMA	182	0,76
Homoarginin	2807	0,05
Arginin	8574	0,016

9.6 Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit der ELISA-Methode wurde durch die Ermittlung der Intra- Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten gezeigt (Konzentrationsangaben in µmol/l):

9.6.1 Intra-Assay Katze

Probe	Anzahl n	Mittelwert	SD	VK [%]
K1	40	0,837	0,064	7,6
K2	40	0,862	0,049	5,7
K3	40	0,770	0,058	7,7

9.6.2 Intra-Assay Hund

Probe	Anzahl n	Mittelwert	SD	VK [%]
H1	40	0,531	0,061	11,5
H2	40	0,804	0,068	8,5
H3	40	0,776	0,046	5,9

9.6.3 Inter-Assay Katze

Probe	Anzahl n	Mittelwert	SD	VK (%)
K1	32	0,49	0,037	7,5
K2	32	0,59	0,043	7,3
K3	32	0,72	0,079	11,0
K4	32	0,74	0,058	7,8
K5	32	0,84	0,068	8,1
K6	32	0,84	0,982	9,7

9.6.4 Inter-Assay Hund

Probe	Anzahl n	Mittelwert	SD	VK (%)
H1	32	0,49	0,042	8,5
H2	32	0,66	0,046	7,0
H3	32	0,76	0,063	8,2
H4	32	0,93	0,069	7,4
H5	32	1,21	0,128	10,6
H6	32	1,35	0,152	11,3

9.7 Methodenvergleich

Korrelation ELISA zur LC-MS/MS Methode

SDMA Hund

SDMA Katze

9.8 Kalibrierung

Die Kalibrierung erfolgt durch Einwaage der Reinsubstanz. Die Richtigkeit der Methode wurde durch den Vergleich mit dem Referenzbereich (9.1) und dem Methodenvergleich (9.7) festgestellt.

9.9 Grenzen der Methode

Das Ergebnis des SDMA Elisas ist im Zusammenhang mit weiteren diagnostischen Verfahren und der Anamnese und der daraus resultierenden Fragestellung zu sehen.

Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen wurden, müssen mit Wasser (s. 9.4) verdünnt und erneut bestimmt werden.

9.10 Interferenzen

Hämolytische, lipämische und ikterische Proben sollten nicht eingesetzt werden.

10. Literatur

• Josipa Kuleš, Petra Bilić, Blanka Beer Ljubić,Jelena Gotić, Martina Crnogaj, Mirna Brkljačić, Vladimir Mrljak. Glomerular and tubular kidney damage markers in canine babesiosis caused by Babesia canis Ticks and Tick-borne Diseases (2018) 9 1508 - 1517
• Bode-Böger S.M., Scalera F., Kielstein J.T., Martens-Lobenhoffer J., Breithardt G., Fobker M., Reinecke H. Symmetrical Dimethylarginine: A new combined parameter for renal function and extent of coronary artery disease J. Am. Soc. Nephrol. (2006) 17: 1128-1134
• Kielstein J.T., Salpeter S.R., Bode-Böger S.M., Cooke J.P., Fliser D. Symmetric dimethylarginine (SDMA) as endogenous marker of renal function – a meta-analysis Nephrol. Dial. Transplant (2006) 21: 2446 – 2451

11. Änderungen

Version _15: Änderungen sind grau unterlegt. Ergänzte Gefahrensymbole sind ab SAE201 gültig.

Version _14: Änderung in Abschnitt 4 ist in grau unterlegt und ab SAE200 gültig.

Version _13: Ergänzungen/Änderungen sind in grau unterlegt.

Version _12: In Abschnitt 4 wurde das Gefahrensymbol "Achtung" beim POD Konjugat entfernt, da nicht mehr notwendig.

Version _11: Die Arbeitsanleitung wurde neu formatiert. Abschnitt 7 und Pipettierschemata wurden um die Komponentenbezeichnung laut Etikett ergänzt, um die Zuordnung zu erleichtern. Es wurden keine Änderungen an den Komponenten oder an der Durchführung vorgenommen.

Pipettierschema - Probenvorbereitung

	Standards	Kontrollen	Proben
ACYL-PLATE:
CAL 1–6 µl	20
CON 1 & 2 µl		20
Probe µl			20
ACYL-BUFF µl	20	20	20
gelöst. EQUA-REAG µl	200	200	200

gelöst. ACYL-REAG, frisch µl

50

50

50